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创新快捷的荧光检测评估方案——以荧光(共聚焦)显微镜分辨率为例

2021/4/9


Confocal(激光共聚焦显微镜)现在已经司空见惯,甚至是超分辨(SIM)也是屡见不鲜,今天我们就定性和定量两个方面分析显微成像系统的性能(以分辨率为例),从而更了解系统性能好坏,才能在选择显微镜时做到有的放矢

这次我们主要测试对象为奥林巴斯(Olympus SpinSR超高转盘共聚焦系统,搭载超分辨模块SpinSR10,配以Photometrics 公司的Prime 95B相机。

一、定性分析

利用共聚焦模块与超分辨模块分别在100倍油镜下扫描,采集成像。样品采用Argolight标准测试片Argo-SIM。此测试片中的图样由激光写入,不仅无光漂白效应,而且常见波段皆可被激发,使用方便。

通过标准测试片中的“间距渐变线对”图样可以快速定性评估系统空间分辨率及信噪比。ArgolightArgo-SIM标准片中共有4组间距渐变线对,分别朝向四个方向,用以测试显微镜对不同方向的分辨率。线对间距以0 nm为起点,30 nm为步进递增至390 nm

图一:用户在观看“间距渐变线对”图样激发光488nm

实时预览状态下,我们仅用肉眼就可以看出线对之间有无明显分开,以此大致判定系统的分辨率。线对从下往上数,如从n根可以分开显微镜的分辨率大致为(n-1*30nm左右。以下图为例:

图二 定量分析示意图

但是,人眼判断的精确度有限。对于关注方法学的人,仅仅定性分析已不能满足需求。需要对相关结果定量分析,得出更准确的值。

二、定量分析

第二阶段,我们将上述采集到的图像分别送入Argolight测试片配套的图像分析软件Daybook中自动计算出分辨率结果。为了得到更为准确的结  果,分析过程中截取图像不同区域,分别计算出其分辨率,平均计算得出最终分辨率数值。

Daybook软件对比度测量计算图

分析过程中,Daybook软件首先自动识别图像中的线对,将强度曲线中的峰值和谷值分别进行标定,之后计算不同线对之间峰值和谷值得光强对比度见图三)。另外,软件允许用户选择对比度阈值作为分辨率的判定标准。



Argo-SIM测试片中的“间距渐变线对”图样的成像激发光488 nm

confocal成像 右:超分辨模块成像





图五 Daybook软件测量结果截图

通过此次测试,我们清楚了解该显微镜的实际分辨率,验证了与厂家参数的契合度。同时,有赖于Argolight荧光显微镜测试方案的高效和便捷,整个测试过程耗时不超过30分钟。

Argolight荧光标准评估片除了测试显微镜分辨率外,还可以测试其它性能如照明均匀度、光强光谱响应度、空间共定位、定位误差等等。可关注后续文章或致电了解更多功能。


(注

1、图片传送压缩问题,图片可能失真。烦请谅解!

2测量最终结果涉及其他厂家相关产品,暂决定不公布相关测量准确数值,如需了解结果可咨询相关厂家。我司仅负责提供相关产品测量方案,不负责具体系统的评测。烦请谅解!